El mecanismo de atenuación en los operones catbólicos de aminoácidos.

Modificado de un texto en línea de J. Frank Baker por Humberto González-Márquez.  

La regulación efectiva de la biosíntesis de aminoácidos es de importancia vital en la célula. La atenuación, que controla a la RNA polimerasa en varias etapas de la transcripción, es un mecanismo muy utilizado. Para presentar este tema lo más ampliamente posible se considerarán el mecanismo general de la atenuación del operón de triptofano en Escherichia coli y Rhizobium meliloti, los efectos de varias concentraciones de triptofano dentro de estos sistemas y el efecto de introducir mutaciones en el operón de fenilalanina de Escherichia coli.
La atenuación es un mecanismo de control que se encuentra principalmente en genes procarióticos, está involucrado con los operones que codifican para la biosíntesis de aminoácidos (2,3,5). Este tipo de regulación es usado frecuentemente en conjunto con un sistema de regulación represible, tal como el del operón de triptofano (3-6), para un control fino de la síntesis de las proteínas codificadas por el operón. Frecuentemente, como es el caso de los aminoácidos histidina y leucina en Escherichia coli, la atenuación es el único método de regulación. En la atenuación no están involucradas proteínas regulatorias que reconozcan a las secuencias repetidas en tamden que aparecen en el mensajero que se está transcribiendo. Estos codones de aminoácidos en tandem aparecen dentro de la región atenuadora como parte de la secuencia transcrita incialmente, o hebra líder (1-6) (Fig. 1).

Figura 1. Secuencia de aminoácidos derivada de la hebra líder.

Operón

Secuencia de aminoácidos de la traducción de la región lider del mensajero

Triptofano Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser
Treonina* Met-Lys-Arg-Ile-Ser-Thr-Thr-Ile-Thr-Thr-Thr-Ile-Thr-Ile-Thr-Thr-Gly-Asn-Gly-Ala-Gly
Histidina Met-Thr-Arg-Val-Gin-Phe-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Pro-Asp
Fenilalanina Met-Lys-His-Ile-Pro-Phe-Phe-Phe-Ala-Phe-Phe-Phe-Thr-Phe-Pro

*Ya que la isoleucina es sintetizada a partir de la treonina, esta última es un constituyente importante de la hebra líder.

El ejemplo de atenuación más estudiado es el del operón de triptofano (2). En algunas bacterias entéricas, incluyendo a Escherichia coli, los genes estructurales trp E, D, C, B, A, de cinco proteínas involucradas en la biosíntesis de triptofano están agrupadas en un solo operón (1,2) (Fig. 2). Este operón se transcribe de un solo promotor, y su expresión está regulada a nivel transcripcional tanto por represión como por atenuación (1-3,5,6). En Acinetobactor calcoaceticus, los genes del triptofano están agrupados en tres diferentes locaciones y todos ellos son regulados por el triptofano (1). Por otra parte, Chromobacterium violaceum no regula ninguno de sus genes del triptofano transcripcionalmente (1). En Rhizobium meliloti estos genes están agrupados en tres diferentes locaciones cromosomales. Estos grupos son trpE(G), trpDC, y trpFBA (1). En R. leguminosarum, un pariente cercano de R. meliloti, los grupos trpDC, y trpFBA no están regulados. trp E(G) de R. meliloti es regulado por atenuación mientras que otros grupos de trp no se han investigado suficientemente (1).


 

Figura 2. Operón de triptofano y codón de fin de traducción en E. coli.


La traducción de la secuencia líder es el factor determinante para que la transcripción posterior prosiga o termine (1-6). Si la poza de triptofano está llena en la célula, el péptido líder se sintetizará. Si, por el contrario, la concentración de triptofano es baja, el péptido líder no se sintetizará. Si el péptido líder se sintetiza, la célula tiene suficiente triptofano y resulta en una terminación de transcripción. Si la síntesis del péptido líder no ocurre, entonces la célula necesita triptofano y la transcripción continuará. La poza de triptofano en bacterias y en todos los demas grupos de organismos está compuesta de dos compartimentos, el triptofano libre y el aminoacil-tRNA de triptofano cargado (tRNA-Trp o triptofanil-tRNA).
El hecho de que la traducción del péptido líder regule la transcripción de genes que se encuentren corriente abajo puede ser explicada porque estos dos procesos ocurren virtualmente simultáneos en procariontes (2). Mientras que la transcripción corriente debajo de la secuencia del DNA todavía está en proceso, la traducción de secuencias ya transcritas ya empezó (2). La atenuación ocurre porque una porción de los mRNA recién formados se dobla en una asa de doble cadena que le señala a la actividad de la RNA polimerasa de detenerse (2,3,6). La estructura de tallo y bucle está constituida por dos regiones de nucleótidos del mRNA cercanas que son complementarias y que pueden aparearse (2,6). Si el triptofano es suficiente, los ribosomas traducirán la secuencia líder hasta el codón de terminación, recibiendo (2-4). El resto del RNA líder puede formar un tallo y bucle (sitios 3 y 4 en Fig. 3) que están seguidos por ocho residuos de uridina que causan la terminación (6).


 

Figura 3. Efecto de la alta concentración de triptofano sobre la atenuación.


Cuando el triptofano se encuentra en bajas concentraciones, el ribosoma se detiene durante la traducción antes del codón de terminación esperando un tRNA-Trp (2,3,6). Esto permite la formación de un tallo y bucle alternativo (sitios 2 y 3 en la Fig. 4) que no es un terminador y efectivamente evita que se forme el terminador (6). Un punto importante es que la velocidad al la que el ribosoma traduce un gen no es constante para cada Transcrito. Cuando el triptofano está presente en cantidades medias, ni abundante ni totalmente ausente, algunos transcritos se terminarán y otros no (3). Así, la expresión del operón de triptofano puede ser modulado a los requerimientos precisos de la célula.

Figura 4. Efecto de la baja concentración de triptofano sobre el atenuador.


Para determinar los efectos de la falta de triptofano sobre la represión y atenuación, Charles Yanofsky, Richard Kelley y Virginia Horn analizaron los niveles de enzimas y mRNA en cepas lisogénicas que contenían un indicador de la represión modificado por ingeniería genética (5). Este fago indicador lleva una fusión del promotor-operador de trp con el gen lacZ. En los lisógenos que contenían este fago, los niveles de la actividad de b-galactosidasa y/o del mRNA de trpE, productos del operón trp residente, se usaron para determinar las contribuciones reguladoras de la represión y de la atenuación. Los valores resultantes mostraron que la represión regula la expresión del operón cerca de 80 veces y la atenuación contribuyo unas seis veces más (5). La contribución de la atenuación fue calculada de las actividades enzimáticas observadas de lacZ (represión solamente), y de trpE (represión más atenuación) (5). Fue aparente que sólo cuando la represión era esencialmente eliminada hubo una relajación significativa de la atenuación.
Esta observación fue consistente con el hallazgo de que el tRNA-Trp estaba cargado 65% en los cultivos en los que la represión fue liberada 55% (5). En concordancia con estas observaciones, también estaba el hecho de que la taza de crecimiento de varios braditrofos de trp (un plásmido indicador usado para determinar el tRNA-Trp) en medio mínimo fue idéntica a la de la cepa silvestre, hasta los niveles de las enzimas trp se acercaron o excedieron los de una cepa deficiente en el represor (5). El cargado del tRNA-Trp no representa una limitación para el crecimiento hasta que las concentraciones de triptofano fueron tan bajas que eran inadecuadas para activar el apo-represor de trp (5).
Solamente cuando una fracción apreciable del tRNA-Trp estaba descargada, se esperaría que el ribosoma que traduce la región que codifica para el péptido líder permaneciera por un periodo grande sobre uno de los codones de trp. De esta manera el arreglo de los dos codones puede determinar que la atenuación se relaje solamente en una situación de falta grave de triptofano (5). Estas consideraciones parecen sugerir que la represión y la atenuación juegan independientemente en regular la transcripción del operón de trp.
En medio mínimo la expresión del operón de trp estaba elevada generalmente porque la proteína sensible a la retroalimentación, trpE, estaba sólo parcialmente inhibida por el triptofano (5). Cuando se compararon cualquier par de cepas trpR que producían proteínas trp E resistentes o sensibles a la retroalimentación, la expresión de los operones fue menor cuando la proteína trpE era resistente a la retroalimentación (5). Aunque E. coli emplea dos mecanismos para el control de la transcripción del operón trp, se producen el doble del nivel de productos del gen trp de los que son necesarios por lo que el control por retroalimentación puede utilizarse para regular el flujo de carbón a la ruta del triptofano (5).
Para confirmar que la secuencia del sitio de terminación estaba dentro del péptido líder y el efecto de variar los niveles de triptofano, los investigadores Young Min Bae e Irking Crawford (1) utilizaron a la bacteria Rhizobium meliloti. Recordemos que en R. meliloti, los genes del triptofano están agrupados en tres diferentes sitios del cromosoma trpE(G), trpDC y trpFBA (1).
El RNA de R. meliloti RCR2011 (cepa silvestre) crecida en medio mínimo M9 con 10 mg de triptofano por ml, se aisló e hibridizó usando como sonda un fragmento de 120-pb NcoI-Sau961 del plásmido pEG220. El fragmento NcoI-Sau961 utilizado en este experimento fue marcado por traslado de mella (nick translation) contiene la secuencia líder trpL y el atenuador pero no la región de trpE(G) distal al brazo 3:4 del atenuador (1). Utilizando el análisis del Norhern blot (hibridación sobre membrana después de separación electroforética y transferencia sobre la membrana), el resultado fue una banda de aproximadamente 110 pb. Contando 110 bases desde el sito de inicio de la transcripción indica que este transcrito fue terminado en la zona de un residuo de timina que sigue a la estructura de pasador 3:4 (1).
Para determinar el efecto de variar la concentración de triptofano, un fragmento de 393 pb SalI-SalI con el gen estructural de trpE(G) y el fragmento NcoI-Sau961 del párrafo anterior se usaron como sondas (1). La cepa trpC de R. meliloti se cultivó en medio mínimo M9 con 2, 10, 18, 26 y 34 mg de triptofano por ml y el RNA de estos cultivos se preparó de estos cultivos y se hibridizó con las sondas descritas (1).
El análisis del blot indicó que la cantidad de RNA con el transcrito líder era constante sin importar la concentración de triptofano (1). Sin embargo, la cantidad de mRNA que contenía a la región trpE(G) disminuye al mismo tiempo que la concentración de triptofano se incrementa. Estos experimentos muestran claramente que el inicio de la traducción en el promotor de trpE(G) no está regulada pero la terminación en la estructura en horquilla 3:4 es regulada en respuesta al triptofano.
Para describir las mutaciones que bloquean la traducción normal de la región que codifica al péptido líder y analizar sus efectos en la regulación de la atenuación, el gen de la fenilalanina fue considerado por los investigadores Narasatah Gavani y Lakshmidevi Pulakat. El gen pheA de Escherichia coli codifica para una enzima bifuncional, la corismato mutasa/prefenato deshidratasa que cataliza para los dos primeros pasos, de tres, en la biosíntesis de la fenilalanina a partir de corismato (4). La expresión de este gen está regulada por atenuación en un terminador de transcripción localizado corriente arriba de el gen estructural de pheA (Fig. 1).
La primera mutación se generó cambiando el residuo de guanina del sitio putativo de unión al ribosoma AGGA del transcrito del líder de pheA por un residuo de adenina (4). Esta mutación, designada pheAe1213, tiene una cadena de cuatro residuos de adenina en lugar del sitio convencional de unión al ribosoma para interferir con la unión del ribosoma traductor y disminuir la síntesis del péptido líder de pheA (4). La segunda mutación, designada pheAe24, tenía el codón de inicio de traducción, ATG, del transcrito del líder de pheA remplazado por un codón de isoleucina, ATA, que no puede iniciar la traducción. La tercera mutación pheAe3334, fue construida convirtiendo el codón de prolina, CCG, localizado corriente arriba de los codones en tandem de fenilalanina con un codón stop, UAG (4). Esto se realizó para examinar el efecto de inducir un codón stop justo corriente arriba del la estructura de tallo y bucle 1:2 del Transcrito del líder de pheA sobre la regulación de pheA. Estas mutaciones fueron clonadas para producir un operón de fusión con el promotor de pheA y el gen lacZ para ser introducidos en huéspedes de E. coli como se describe a continuación.
Cuando E. coli NG212 (pheApe1213-lacZ) se incubó en presencia de fenilalanina la actividad de ß-galactosidasa de esta cepa disminuyó cerca de cuatro veces comparado con la actividad b-galactosidasa de E. coli NG212 (pheApe1213-lacZ) (4). Cuando se eliminó completamente la fenilalanina, la actividad
b-galactosidasa de E. coli NG212 (pheApe1213-lacZ) no cambió. Esto parecería indicar que el transcrito líder de pheA necesita un sitio eficiente de unión a ribosomas para asegurar un nivel basal óptimo de expresión así como también para desatenuar completamente al gene pheA cuando las células se encuentran sin fenilalanina. Que la presencia de un sitio deficiente de unión a ribosomas en la región que codifica para el péptido líder de pheA incremente la formación del terminador cuando las células se crecieron en presencia o ausencia de fenilalanina confirmó esta conclusión (4).
La actividad
b-galactosidasa de E. coli NG212 (pheApe1213-lacZ) se incrementó casi 6 veces comparado con E. coli NG211 (pheApeWT-lacZ) en presencia de fenilalanina (4). Sin embargo, cuando a las células mutantes se les restringió la fenilalanina, la actividad de b-galactosidasa no cambió, indicando que la habilidad del atenuador de pheA a responder a la restricción de fenilalanina se había perdido (4). Por esta razón, un ribosoma traductor que alcanza este codón stop interferiría con la formación de la estructura del tallo y bucle 1:2, facilitando la formación de la estructura tallo y bucle 2:3 e incrementando el nivel de expresión basal de la fusión transcripcional pheApe3334-lacZ (4).
Un factor de liberación mutante (RF1) que es específico para UAG se introdujo en E. coli NG214 para verificar el papel del ribosoma traductor situado sobre el codón stop UAG localizado en la quinta posición del transcrito líder de pheA (4). La actividad de b-galactosidasa de esta mutante designada como E. coli NG214::RF1 fue de 15 veces más alta que la actividad de b-galactosidasa de E. coli NG211 (pheApeWT-lacZ) cuando las células se crecieron en presencia de fenilalanina (4). Así, la actividad de b-galactosidasa de E. coli NG214::RF1 en presencia de fenilalanina fue igual a la actividad de b-galactosidasa de E. coli NG211 (pheApeWT-lacZ) cuando las células se crecieron sin fenilalanina (4). La presencia de un factor liberador previno la formación de una estructura de tallo y bucle 1:2 y facilitó la formación de un antiterminador, llevando a una completa desrepresión del atenuador de pheA (4).
Los datos presentados indican claramente que la concentración del aminoácido específico, phe o trp en los ejemplos anteriores, son el factor decisivo que determina si el péptido líder será sintetizado. A la vez, la síntesis del péptido líder es el factor determinante para la atenuación, indicando si la concentración de los aminoácidos mencionados es suficiente.


Literatura citada

  1. Bae,Y.M. and Crawford, I.P. 1990. The Rhizobium meliloti trpE(G) gene is regulated by attenuation, and its product, anthranilate synthase, is regulated by feedback inhibition. J Bacteriol, 172: 3318-3327.
  2. Brock, T.D., Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker, J. 1994. Macromolecules and Molecular Genetics. 174-175. en: Biology of Microorganisms, Seventh Edition. Prentice Hall, New Jersey.
  3. Brown,T.A. 1992. Control of Gene Expression. 163-164. Genetics: A Molecular Approach, Second Edition. Chapman and Hall, New York.
  4. Gavini N, Pulakat L. 1991. Role of translation of the pheA leader peptide-coding region in attenuation regulation of the Escherichia coli pheA gene. J Bacteriol. 173: 4904-4907.
  5. Horn, V., Kelley, R.L., and Yanofsky, C. 1984. Repression is relieved before attenuation in the trp operon of Escherichia coli as tryptophan starvation becomes increasingly severe. J Bacteriol. 158: 1018-1024.
  6. Klug, W. S. and Cummings, M.R. 1991. Genetic regulation in Bacteria and Bacteriophages. 545-550. Concepts of Genetics, Third Edition. Macmillian Publishing, New York.